킹오파 13 다운로드

FA1090 오파 유전자 결실 구조. FA1090 Gc에서 모든 오파 유전자의 위치 및 특성은 보충 물질에 표 S1에 열거되어 있다. 각 오파 유전자의 프레임 내 삭제는 오버랩 확장 PCR(42)을 사용하여 생성되었다. 각 오파 궤적의 업스트림(fragment A) 및 다운스트림(단편 B)의 약 0.5~1kb의 서열이 FA1090 1-81-S2 P+nv 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 증폭되었다(프라이머 서열에 대한 보충 물질 및 표 S3에 대한 보충 물질S2 참조 PCR 조건에 대 한). 삭제는 대부분의 오파 개방 판독 프레임(ORF)을 HpaI 제한 부위로 대체하도록 설계되었습니다(보충 물질의 표 S2의 프라이머 시퀀스에 밑줄). 이 제품은 pCR-Blunt TOPO (인비트로겐) 또는 pSmart (루시겐)로 복제하고 화학적으로 유능한 TOP10 대장균으로 변형되었으며, opaC를 제외하고 는 DNA 시퀀싱으로 겹침 연장 생성물이 확인되었습니다. 직접 Gc로 변환 (아래 참조). 삽입 함유 플라스미드는 QiaPrep 미니프렙 키트(Qiagen)를 사용하여 대장균으로부터 분리되었고, 정확한 오파 결실 서열은 DNA 염기서열 분석(Genewiz)에 의해 확인되었다. opaF, opaG 및 opaJ에서 겹치는 확장 PCR 제품을 생성할 수 없었던 경우, 조각 A와 B는 별도로 pSmart 또는 pCR-Blunt TOPO로 복제되었습니다. 플라스미드는 플라스미드 특이적 제한 효소와 함께 HpaI로 소화되고 결실 생성물생성을 위해 함께 결찰하였다.

모든 결실 제품은 ΔopaBEGK 배경(OpaD+var)에서 (i) 위상-ON Opa+ Gc로 변환하기 전에 DNA 염기서열 분석으로 확인하였다. FA1090 ΔopaBEGK Gc는 GCB에 통과되었다. 주로 반투명 한 문화에서 발생하는 불투명 한 식민지는 연속 정제 및 -80 ° C에서 저장되었다. 각각 발현된 Opa 단백질은 FA1090 Opa 특이적 항체의 패널로 웨스턴 블로팅에 의해 결정되었다(아래 참조). 이러한 격리 물 중 변수 OpaD + Gc (OpaD + var)가 있었다. 변형 FA1090에서 오팔리스 Gc를 생성합니다. 변형체 FA1090의 기마 GC로부터 오파 유전자를 삭제하기 위해, 각 개방 판독 프레임의 대부분은 제한 효소 인식 서열로 프레임에서 대체되었다(도 1A). 비선택적 변환 후에 발생하는 CFU는 PCR에 의해 전체 길이 오파를 삭제 구문으로 대체하기 위해 스크리핑되었습니다.

1개의 돌연변이 클론이 모든 11개의 오파 유전자가 순차적으로 삭제될 때까지, 변환의 다음 라운드를 위한 부모로 봉사했습니다. 삭제된 처음 4개의 오파 유전자는 FA1090 ΔopaBEGK Gc를 산출하기 위하여 반투명 Opa 단백질 OpaB, E, G 및 K를 인코딩했습니다. 나머지 일곱 은 다음 전체 오파 삭제를 산출하기 위해 삭제, 여기에 Opaless라는. PCR 분석은 4개의 의도된 오파 유전자를 보여주었고 그 외는 ΔopaBEGK Gc에서 삭제되지 않았으며, 11개의 오파 유전자는 모두 Opaless Gc에서 삭제되었다(도 1B). 오파-록카 브랜치 라이브러리는 마이애미-데이드 공공 도서관 시스템에 포함된 49개 지점 중 하나입니다.